光學(xué)顯微鏡中生物細(xì)胞的溫度控制面

臨的挑戰(zhàn)和解決方案

眾 所 周 zhi溫度的變化對(duì)化學(xué)反應(yīng)速率和生物機(jī)理都會(huì)產(chǎn)生影響，如何精準(zhǔn)地控制“實(shí)驗(yàn)溫度"以及研究不同溫度下的實(shí)驗(yàn)樣本狀態(tài)尤為重要。因此，我們從成像樣品溫度控制面臨的常見問題出發(fā)，致力于實(shí)現(xiàn)對(duì)顯微鏡視野中的溫度進(jìn)行高靈敏度的熱控制，由此獲得更嚴(yán)謹(jǐn)可靠且可重復(fù)的數(shù)據(jù)。

圖1：VAHEAT系列溫度控制器

一、顯微鏡中溫度控制問題：

1.液體樣品蒸發(fā) - 介質(zhì)濃度變化，在較冷表面凝結(jié)；

2.溫度漂移；

3.溫度范圍有限（最大 45–55°C），標(biāo)準(zhǔn)控制系統(tǒng)中無法實(shí)現(xiàn)快速溫度變化；

4.在較高溫度下圖像質(zhì)量下降或 TIRF 角度損失；

5.某些設(shè)置的復(fù)雜性——多個(gè)反饋回路，需要特定的溫度校準(zhǔn)；

6.不同的溫度和整個(gè)視場的溫度梯度 - 作為散熱片的浸泡物鏡。

圖 2：a) 使用 63x/1.4 NA 油浸物鏡時(shí)的散熱效果表征。平衡至 37°C 的大型環(huán)境室不足以將樣品保持在 37°C。當(dāng)浸入式物鏡接觸樣品時(shí)，溫度至少降低 3°C，并且永遠(yuǎn)不會(huì)回到 37°C，因?yàn)槲镧R連接到顯微鏡主體，顯微鏡主體在室溫下位于腔室外部。VAHEAT 用于表征溫度下降并補(bǔ)償物鏡的冷卻效果。開啟 VAHEAT 后，熱沉效應(yīng)僅在qian 10 秒內(nèi)出現(xiàn)，當(dāng)溫度降至 36.2°C 時(shí)，儀器反饋回路會(huì)對(duì)其進(jìn)行校正。這樣，樣品始終精確地保持在 37°C。b) 旋轉(zhuǎn)圓盤共焦裝置光學(xué)成像中心 Erlangen，數(shù)據(jù)采集地。

二、顯微鏡溫度控制的常規(guī)解決方案

圖3 傳統(tǒng)生物溫度控制設(shè)備

傳統(tǒng)的溫度控制解決方案沒有一種設(shè)備可以wan 美地適合每個(gè)對(duì)溫度敏感的實(shí)驗(yàn)，往往需要根據(jù)特定的應(yīng)用為一個(gè)顯微鏡系統(tǒng)購買多個(gè)設(shè)備，然后有益地組合在一起。目前主要的解決方案有：

(1) 顯微鏡周圍的大型環(huán)境箱。缺點(diǎn)是溫度測(cè)量距離樣品很遠(yuǎn)，溫度變化可能非常緩慢。

顯微鏡需要幾個(gè)小時(shí)才能達(dá)到熱平衡，緩慢的平衡也意味著與溫度相關(guān)的樣品漂移更顯著。

(2) 平臺(tái)頂部孵化器/加熱平臺(tái)插入物與客觀加熱器相結(jié)合。當(dāng)使用浸油物鏡時(shí)，這是一種有效但相當(dāng)復(fù)雜且昂貴的解決方案。

(3) 基于 Peltier 元件的設(shè)備，具有wu 與 倫 比的溫度范圍，速度快且精確，但難以小型化，并且始終需要連接到元件上的散熱片，例如更大的金屬塊，這可能是不切實(shí)際的。

(4) 基于液體流動(dòng)的設(shè)備。用途廣泛且運(yùn)行速度快，但不是很人性化。

(5) 另一種選擇是自己構(gòu)建溫度控制器。主要適用于商業(yè)，因?yàn)槠涑杀靖咔也痪哂衅者m性。

三、使用 VAHEAT 精確控制溫度

“VAHEAT"溫度控制系統(tǒng)操作簡單，且不必?fù)?dān)心校準(zhǔn)或降低圖像質(zhì)量的問題，更重要的是可精確控制視場中的實(shí)際樣品溫度，并適用于單分子和超分辨率研究等高靈敏度顯微鏡應(yīng)用設(shè)備。該裝置由四部分組成，分別是：(1)智能基底(2)顯微鏡適配器(3)探測(cè)頭(4)控制單元。核心部件是智能基底，這是一個(gè)可交換的部件，包含一個(gè)精確的四點(diǎn)溫度探頭和一個(gè)透明的薄膜加熱元件（如圖4所示）。使用 VAHEAT，溫度可以高達(dá)每秒 100°C 的速率變化，穩(wěn)定誤差在遠(yuǎn)低于 0.1°C 的設(shè)定值，且無需對(duì)顯微鏡進(jìn)行任何修改。VAHEAT 的核心是智能基板，功能化顯微鏡玻璃蓋玻片，其中靈敏的溫度探頭和透明加熱元件連接成一個(gè)有源反饋回路。Smart Substrates 每秒讀取和調(diào)節(jié)樣品溫度 83 次，確保它在不受環(huán)境條件影響的情況下精確地保持在設(shè)定值。Smart Substrates 還提供帶液體樣品容器的版本。該設(shè)備允許對(duì)類似于 PCR 循環(huán)儀的任意溫度曲線進(jìn)行編程，并且與微流體兼容。雖然主要用于倒置配置中的高 NA 物鏡，除此之外，VAHEAT 系統(tǒng)的模塊化允許將其安裝在絕大多數(shù)光學(xué)顯微鏡上。

我們選擇了由氧化銦錫 (ITO) 制成的透明薄膜元件和直接內(nèi)置在單個(gè)芯片中的溫度探頭的加熱策略，蓋玻片，樣品安裝在其上，見圖 3，這種基于 ITO 層的加熱解決方案最有利于熱均勻性。

圖 4：a) VAHEAT 組件。該設(shè)備由智能基板 (1) 智能基底 (2)顯微鏡適配器 (3) 探測(cè)頭 (4)控制單元。b) 智能基板是功能化蓋玻片，帶有透明的納米加熱元件和直接在視野中的溫度探頭。c) 當(dāng) VAHEAT 設(shè)置為 60°C 時(shí)，智能基板的熱圖像顯示整個(gè)區(qū)域均勻加熱。

圖 5：智能基板，VAHEAT 中使用的透明加熱元件（基底可定制）

由于 VAHEAT 僅加熱少量樣品，因此它可以在高溫下與高 NA 浸油物鏡一起使用。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，我們使用尼康 TIRF 100x/1.49 NA 物鏡在 75.0°C 下運(yùn)行 VAHEAT 六小時(shí)，物鏡在前三個(gè)小時(shí)內(nèi)由5°C 升溫至 29°C 并達(dá)到平衡，這表明 VAHEAT 可在更高的實(shí)驗(yàn)溫度下使用。同時(shí)，VAHEAT 可以幫助所有生命科學(xué)家進(jìn)行溫度敏感實(shí)驗(yàn)，對(duì)于某些領(lǐng)域，例如嗜熱微生物的實(shí)時(shí)成像、熱響應(yīng)聚合物的表征或 DNA 納米技術(shù)，它是一項(xiàng)突破性技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)以前無法實(shí)現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)。自 2020 年推出以來，已開始使用我們的設(shè)備的 50 個(gè)實(shí)驗(yàn)室和公司在各個(gè)領(lǐng)域開展工作，例如單分子生物物理學(xué)、膠體化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)。他們使用 VAHEAT 研究相變、液晶、脂質(zhì)層和囊泡以及人工細(xì)胞、ji 端微生物、熱休克反應(yīng)或溶液中的 DNA 和蛋白質(zhì)。引用我們?cè)O(shè)備的第一批出版物現(xiàn)已發(fā)布。VAHEAT 被 Guillaume Baffou 教授（菲涅爾研究所）的實(shí)驗(yàn)室用于嗜熱細(xì)菌的活細(xì)胞成像，以研究限制對(duì)細(xì)菌生長的影響1。在 Wolfgang Zachariae 博士（生物化學(xué)領(lǐng)域的 MPI）的團(tuán)隊(duì)中，在一個(gè)關(guān)于驅(qū)動(dòng)減數(shù)分裂的機(jī)制的研究項(xiàng)目中，VAHEAT 被用于通過共聚焦顯微鏡對(duì)酵母中的溫度敏感等位基因進(jìn)行熱休克和活細(xì)胞成像2。VAHEAT 還被用于在 Henrik Dietz 教授（慕尼黑工業(yè)大學(xué)）的實(shí)驗(yàn)室中使用 DNA 折紙創(chuàng)建人工大分子傳輸?shù)难芯俊Ｔ撗芯渴褂脝畏肿?TIRF 成像進(jìn)行檢測(cè)3。

使用即插即用的 VAHEAT 系統(tǒng)，從實(shí)驗(yàn)中導(dǎo)出溫度記錄也非常簡單。因此，我們希望該設(shè)備不僅能夠?qū)崿F(xiàn)新型實(shí)驗(yàn)，而且有助于改進(jìn)成像實(shí)驗(yàn)的報(bào)告和可重復(fù)性，從而為每個(gè)人提供高靈敏度顯微鏡。

關(guān)于Interherence：

德國Interherence公司擁有量子和生物光子學(xué)領(lǐng)域的專家團(tuán)隊(duì)，為高靈敏度光學(xué)顯微鏡的發(fā)展做出很大貢獻(xiàn)。該團(tuán)隊(duì)采用了現(xiàn)代納米制造和薄膜技術(shù)，推出了VAHEAT生物顯微溫度控制器，作為傳統(tǒng)顯微鏡的附加產(chǎn)品，shou次實(shí)現(xiàn)了在擴(kuò)展溫度范圍內(nèi)的精確溫度控制，以確保生物物理光學(xué)研究可靠的測(cè)量條件。

上海昊量光電作為德國Interherence公司在中國的代理商，可為您提供專業(yè)的技術(shù)服務(wù)，若您對(duì)Interherence公司提供的VAHEAT生物顯微溫度控制器有興趣，歡迎通過郵箱、電話或微信進(jìn)行溝通！

關(guān)于昊量光電：

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參考文獻(xiàn):

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3. St?mmer, P., A synthetic tubular molecular transport system. Nature Communications, 12, 4393, (2021).